כיצד לבחור חומרים מתכלים ניסיוניים: 8 היבטים שונים של חומרים מתכלים PCR שאתה צריך לדעת

היום, בואו נדבר על מרכיב מרכזי בניסויי PCR - חומרים מתכלים. כמבקר תכוף ב-PCR, יש צורך להבין את המאפיינים והטרמינולוגיה הקשורים לחומרי PCR מתכלים.

קיים בשוק מגוון רחב של חומרים מתכלים ל-PCR, לרבות מותגים, מפרטים, צבעים וכו', מסנוורים. בואו נבין את זה צעד אחר צעד.

צלחת pcr

1. חומרים

בדרך כלל, חומר הגלם של מוצרי PCR מתכלים הוא פוליפרופילן. זהו חומר אינרטי טוב עמיד בחום. טווח טמפרטורת העבודה הוא -30 עד 140 מעלות, מה שמאפשר לו לעמוד בשינויי האנרגיה התרמית במהלך המחזור התרמי של תגובת ה-PCR, וממלא תפקיד טוב באיטום ובהגנה על החומרים במערכת התגובה של PCR.

למידע נוסף על פוליפרופילן

2. צבע

הנפוצים הם צינורות לבנים וצינורות PCR שקופים. בניסויי PCR מסורתיים, אין הבדל בין השניים. עם זאת, באותו ניסוי בזמן אמת/qPCR, צינורות לבנים היו יחסית רגישים ועקביים יותר עבור מכשירי qPCR עם קריאת אותות אפיקלית (ראה איורים A ו-B להלן). למה זה ככה

צינור pcr

ת: ערכי Ct נמוכים יותר עבור צינורות לבנים בהשוואה לצינורות שקופים; ב: יכולת חזרה טובה יותר עם צינורות לבנים.

נתוני הליבה של qPCR הם ערך ה-Ct, ואות הקרינה הוא מקור הנתונים לחישוב ערך ה-Ct, ולכן חשוב מאוד האם ניתן להעביר את הקרינה בצינור במלואה לגלאי. דופן הצינור הלבן מונע מהקרינה לעבור דרך דופן הצינור ולהישבר (איור א' למטה), ובכך מונעת את העברת הקרינה לבלוק החימום (כלומר, דופן חור המתכת שבו מוצב הצינור) ולהיספג. או משתקף באופן לא עקבי על ידי החסימה. אות פלורסנט חזק ומרוכז יותר נאסף בקצה הצינור הלבן בהשוואה לצינור השקוף (איור B למטה).

צינור pcr

ת: המגמה המשתנה של אות הקרינה בצינור השקוף ובצינור הלבן; ב: השוואת עוצמת הקרינה לאחר הוספת אותה כמות של פלואורסצין.

אז אם אתה משתמש במכשיר qPCR בעל קריאה עליונה, נסה צינורות לבנים.

3. איכות (רזה או לא רזה)

חשיבותה של איכות מתכלים מודגשת כאן. חומרים מתכלים של qPCR חייבים להיות נקיים ממזהמים ומעכבים. לחץ גבוה וקרינה מסירים חיידקים ו-DNases, אך לא שאריות אבק ו-DNA, שעלולים לעכב תגובות PCR או לייצר הגברה לא ספציפית. לחומרים יש ספיגה, ואפילו מזהמים זעירים יספגו את הקרינה במערכת התגובה וישפיעו על איסוף אותות הקרינה. נעשה שימוש בגרסה מוגזמת של הניסוי כדי להדגים את השפעת זיהום הטומאה על הניסוי. כפי שמוצג באיור למטה, טומאה הונחה באחת מבורות התגובה של האוקטבה. כצפוי, עקומות ההגברה הראו חריגות ניכרות.

זיהומים בצינורות תגובה PCR

↑ זיהומים בצינור התגובה

8 רצועות

↑ תוצאות תגובה חוזרות עבור 8 צינורות, טומאת הבאר השמאלית "סוטה" מהעקומה.

תזכורת: היזהר לא לחשוף את החומרים המתכלים לאוויר לאורך זמן. לאחר הוצאת החומרים המתכלים, הקפידו לאטום את שקית האריזה במהירות כדי למנוע מגע בה בידיים חשופות. אם אפשר, עבדו על ספסל נקי.

4. קיבולת / גודל / שטף

הנפח קובע כמה דגימה (נפח תגובה) ניתן לטעון. מינון יתר עלול לגרום להפחתת יעילות העברת החום, שפיכה או זיהום צולב; מינון נמוך עלול לגרום לאובדן דגימת אידוי. בלוק החימום של מכשיר ה-qPCR יקבע גם את החומרים המתכלים הרלוונטיים ואת גודל מערכת התגובה הרלוונטית. קל להבין את התפוקה, זהו המספר המרבי של דגימות שניתן לטעון בניסוי בודד. מפרטי קיבולת ושטף נפוצים מוצגים בטבלה שלהלן:

צינור בודד/שמונה שורות {{0}}.2 מ"ל, 0.1 מ"ל

{{0}}צלחת באר 0.2 מ"ל, 0.1 מ"ל

{{0}}צלחת באר 0.2 מ"ל

גם מפרטי הקיבולת מחולקים בדרך כלל לסוגים סטנדרטיים ונמוכים, כפי שמוצג להלן. חומרים מתכלים בפרופיל נמוך הם בעלי גובה נמוך יותר. עיצוב קצר זה ממזער את החלל מעל מערכת התגובה ("נפח מת" - החלק חסר התועלת), מפחית את השפעות האידוי במהלך רכיבה תרמית, ומאפשר למודול החימום לעטוף אותו במידה רבה יותר כדי לשפר את יעילות העברת החום. לכן, צינורות בפרופיל נמוך ידועים גם כצינורות או צלחות "מהירים".

צינור pcr

תזכורת: נפח התגובה הנפוץ הוא 20 µL, ומומלץ להשתמש בצינור תגובה בנפח קטן של 0.1 מ"ל או בנפח קטן.

5. עובי דופן

עובי דופן הצינור משפיע ישירות על המוליכות התרמית. חומרי PCR מתכלים צריכים להיות בעלי עובי דופן אחיד כדי לספק העברת חום עקבית. דופן הצינור הדק במיוחד דק יותר ב-50 אחוז מהגרסה הרגילה, מה שמפחית עוד יותר את המחסום התרמי ומביא להשפעות תגובה מהירות וטובות יותר. לכן, על מנת למקסם את היעילות של תגובות PCR ולהבטיח תגובות יציבות ויעילות, מוצרי PCR אחידים ודקים במיוחד הם הבחירה הטובה ביותר.

6. שקיפות

כובעים וסרטי איטום עבור qPCR דורשים בהירות אופטית גבוהה כדי להבטיח חדירה ושידור אופטימליים של אותות ניאון תוך הפחתת העיוות (עבור מכשירי qPCR בעלי קריאה עליונה). ככל שהשקיפות של דופן הצינור גבוהה יותר, זה עשוי להשפיע על תוצאות הניסוי. הסיבה הוסברה לעיל. PCR מסורתי יכול להתעלם מתכונה זו.

7. חצאיות

החצאית של צלחת PCR מתייחסת להרחבה ההיקפית של הצלחת. בעת בניית מערכות תגובה, החצאית פועלת כתמיכה יציבה לתהליכי פיפטציה ומספקת חוזק מכני ואחיזה בשילוב עם תחנות עבודה אוטומטיות. ישנם שלושה סוגים נפוצים של חצאיות, חצאיות חצאיות וחצאיות מלאות (המקבילות ל-A, B ו-C באיור למטה).

ללא חצאית: ניתן להשתמש עם רוב מכשירי PCR או qPCR, אך לא עבור יישומים אוטומטיים. קל להזזה במהלך פיפטציה, לא יציב במיוחד, צריך להשתמש בו עם מחזיק לצלחת.

חצאיות חצאיות: אידיאליות ליישומים אוטומטיים עם יציבות פיפטציה טובה.

צלחת חצאית מלאה: אידיאלית ליישומים אוטומטיים. חוזק מכני טוב, מתאים למכשירי PCR עם מודולים בולטים, יציבות גבוהה בזמן פיפטציה.

צלחת pcr

טיפים: המשמעות של החצאית היא יותר להקל על התיעוש ועיבוד אצווה אוטומטי, בשילוב עם הזרוע הרובוטית. ייתכן שלא יהיה צורך בכך במעבדות מחקר מסורתיות, אף חצאית לא מספיקה.

צלחת pcr

8. פאראפילם

סרט איטום לוחות PCR עשוי מפלסטיק שקוף או רדיד אלומיניום. סרטים שקופים דביקים נפוצים יותר, מתאימים לצלחות של 96 או 384 באר, וצריכים להיות בעלי העברת אור טובה מספיק. בעת איטום הסרט, כרטיס קטן ישמש כדי ללחוץ את הסרט סביב חור האיטום כדי למנוע דליפת אוויר.

סרטי אלומיניום דביקים עשויים להיות פחות נפוצים. למרות שאינו מתאים ל-qPCR, זהו החומר המתכלה האידיאלי עבור דגימות רגישות לאור. מכיוון שניתן לנקב אותו, הוא מקל על העברת דגימות ב-PCR (עבור PCR קונבנציונלי).

סרט איטום לוחות PCR

לְסַכֵּם

בתור הספק של מערכת PCR, חומרים מתכלים חשובים מאוד לשיפור איכות הנתונים הניסיוניים. אני מקווה ששיתוף זה יכול לעזור לך להבין כמה טיפים על חומרים מתכלים ל-PCR ולספק עזרה לבחירה טובה יותר של חומרים מתכלים.