1. בצלחת התרבות, השרו את השקופיות שעליהן טיפסו עם PBS שלוש פעמים למשך 3 דקות בכל פעם.
2. תקן את השקופיות עם 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 15 דקות, והשרו את השקופיות ב-PBS למשך 3 פעמים, 3 דקות בכל פעם.
3. חלחל עם 0.5 אחוז Triton X-100 (הוכן ב-PBS) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (עבור אנטיגנים המתבטאים על קרום התא, שלב זה מושמט).
4. חסימת סרום: לטבול את השקופיות ב-PBS 3 פעמים למשך 3 דקות בכל פעם, לייבש את ה-PBS בנייר סופג, להוסיף סרום עיזים רגיל (בתנאי שמקור הנוגדן המשני הוא עז) על השקופיות, ולחסום בטמפרטורת החדר למשך 30 דק.
5. הוספת נוגדן ראשוני: ספגו את התמיסה החוסמת בנייר סופג, אל תשטפו, הוסיפו כמות מספקת של נוגדן ראשוני מדולל לכל שקף והכניסו לקופסה רטובה, דגירה ב-4 מעלות למשך הלילה.
6. הוסף נוגדן משני פלואורסצנטי: לטבול את השקופיות ב-PBST למשך 3 פעמים, 3 דקות בכל פעם, לספוג את עודפי הנוזל על השקופיות עם נייר סופג, להוסיף את הנוגדן המשני הפלורסנטי המדולל טיפה, לדגור ב-20-37 מעלות למשך שעה בקופסה רטובה, משרים ב-PBST Slice 3 פעמים, 3 דקות בכל פעם.
הערה: מהוספת נוגדן משני פלואורסצנטי, יש לבצע את כל השלבים הבאים במקום חשוך ככל האפשר.
7. חסימת סרום: ספגו את הנוזל בנייר סופג, זרוק סרום עיזים רגיל על שקף הזכוכית (בתנאי שמקור הנוגדנים המשני הוא עז), וחוסמים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
8. הוספת נוגדן ראשוני: ספגו את התמיסה החוסמת בנייר סופג, אל תשטפו, לאחר מכן הוסיפו את הנוגדן הראשוני המדולל טיפה, והדגירו לילה בקופסה לחה של 4 מעלות בחושך לאחר הוספת הנוגדן הראשוני. (הערה: המין של הנוגדן הראשוני השני שונה מהמין של הנוגדן הראשוני הראשון, כגון עכבר וארנב)
9. הוסף נוגדן משני פלואורסצנטי: לטבול את השקופיות ב-PBST למשך 3 פעמים, 3 דקות בכל פעם, לספוג את הנוזל העודף על השקופיות עם נייר סופג, להוסיף את הנוגדן המשני הפלורסנטי המדולל טיפה, לדגור ב-20-37 מעלות למשך שעה בקופסה רטובה, משרים ב-PBST Slice 3 פעמים, 3 דקות בכל פעם. (הערה: אם הקרינה האדומה נבחרה לזיהוי של הנוגדן הראשון, השני חייב לבחור צבעים אחרים של הקרינה)
10. גרעיני צביעת נגד: ה-DAPI הוספה טיפה והודגרה בחושך למשך 5 דקות, הדגימות נצבעו, וה-DAPI העודף נשטף עם PBST 5 דקות × 4 פעמים.
11. יבשו את הנוזל על השקף בנייר סופג, אוטמו את השקופית בנוזל הרכבה המכיל מרווה אנטי פלואורסצנטי, צפו ואספו תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
