טכנולוגיית PCR חייבת לסנתז באופן מלאכותי פריימרים סבירים ו-DNA מדגימה, ולאחר מכן לבצע מחזור תרמי אוטומטי, ולבסוף לבצע זיהוי וניתוח המוצר. כיום, עיצוב וסינתזה של פריימר יכול להתבצע רק במכוני מחקר, מכונים ומרפאות בודדים בעלי חוזק טכני חזק. האפליקציה צריכה רק לרכוש את ערכת זיהוי PCR כדי להתחיל בעבודה. ישנם גורמים משפיעים רבים במחזור התרמי האוטומטי של PCR. עבור דגימות DNA שונות, כמות הרכיבים השונים שנוספו בתגובת PCR ופרמטרי מחזור הטמפרטורה אינם עקביים.
מספר גורמים משפיעים עיקריים מוצגים כעת כדלקמן.
האחד, פרמטרים של מחזור טמפרטורה
במחזור התרמי האוטומטי PCR, הגורם הקריטי ביותר הוא טמפרטורת הדנטורציה והחישול. כפי שמוצג בדוגמה של הפעולה, התנאים של דנטורציה, חישול והרחבה הם: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, סך הכל מחזור של 25~30 A, הפרגמנט המוגבר הוא 500bp. כאן, יש לחשב את הזמן של כל שלב לאחר שתערובת התגובה מגיעה לטמפרטורה הנדרשת. במחזור התרמי האוטומטי, הזמן מהטמפרטורה המקורית של התערובת לטמפרטורה הנדרשת לוקח 30-60 שניות. משך זמן ההשהיה תלוי במספר גורמים, כולל סוג צינור התגובה, עובי הדופן, נפח תערובת התגובה, חום מקור (אמבט מים או גוש חימום), והפרש הטמפרטורה בין שני השלבים, אשר צריך להיות מסופק כראוי בעת הגדרת המחזור התרמי. שימו לב ושקול, ויש לבצע מדידה בפועל בכל מכשיר.
שיקול חשוב נוסף לגבי זמן המחזור התרמי הוא המרחק בין שני הפריימרים; ככל שהמרחק גדול יותר, כך לוקח יותר זמן לסנתז את האורך המלא של רצף המטרה. זמן התגובה שניתן לעיל מבוסס על אורך הסינתזה האופטימלי של 500bp. רצף המטרה נערך. לפניכם מבוא לבחירת הטמפרטורות השונות.
1. טמפרטורת הדנטורציה של התבנית טמפרטורת הדנטורציה קובעת את הטמפרטורה שבה נמס ה-DNA הדו-גדילי בתגובת ה-PCR. אם לא תגיע לטמפרטורת הדנטורציה, לא תיוצר תבנית DNA חד-גדילית ו-PCR לא יתחיל. טמפרטורת דנטורציה נמוכה פירושה דנטורציה לא מלאה, דנ"א דו-גדילי זה ישנה מחדש במהירות, ובכך יקטין את התשואה. בדרך כלל 90 ~ 95 ℃. לאחר שהדגימה מגיעה לטמפרטורה זו, יש לקרר אותה במהירות לטמפרטורת החישול. דנטורציה של DNA נמשכת רק כמה שניות, וזה לא הכרחי במשך זמן רב; להיפך, כדאי לנסות כמיטב יכולתך בטמפרטורה גבוהה. קצר אותו כדי לשמור על פעילות ה-Taq DNA פולימראז. טמפרטורת הדנטורציה המקסימלית לאחר הוספת Taq DNA פולימראז לא תעלה על 95 מעלות צלזיוס.
2. טמפרטורת חישול פריימר טמפרטורת החישול קובעת את הספציפיות והתפוקה של PCR; אם הטמפרטורה גבוהה, הספציפיות חזקה, אך אם הטמפרטורה גבוהה מדי, לא ניתן לשלב היטב את הפריימר עם התבנית, ויעילות הגברה של DNA מופחתת; הטמפרטורה נמוכה, התשואה גבוהה, אך נמוכה מדי עלולה לגרום לחוסר התאמה של פריימר ותבניות, עלייה במוצרים לא ספציפיים. בדרך כלל, התחל עם מצב התגובה של 37 ℃, הגדר סדרה של תגובות בקרה כדי לקבוע את טמפרטורת החישול האופטימלית עבור תגובה ספציפית. ניתן גם להסיק על סמך תכולת (G+C)% של הפריימרים כדי לתפוס את הבדיקה. נקודת ההתחלה של הבדיקה הכללית, טמפרטורת החישול Ta (טמפרטורת החישול) נמוכה ב-5℃ מטמפרטורת ההיתוך TTm (טמפרטורת התכה) של פריימר ההגברה, אותו ניתן לחשב לפי הנוסחה:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
ביניהם, A, T, G ו-C מייצגים בהתאמה את מספר הבסיסים המתאימים. לדוגמה, עבור פריימר של 20 בסיסים, אם התוכן של (G+C)% הוא 50%, ניתן להגדיר את נקודת ההתחלה של Ta ל-55°C. בריכוז פריימר טיפוסי (כגון 0.2μmol/L), ניתן להשלים את תגובת החישול תוך מספר שניות, ואין צורך בחישול לטווח ארוך.
3. בחירת טמפרטורת הארכת פריימר תלויה בטמפרטורה האופטימלית של פולימראז של Taq DNA. בדרך כלל 70 ~ 75 ℃, השיעור הסטנדרטי של נוקלאוטידים מזורזים באנזים ב 72 ℃ יכול להגיע ל 35 ~ 100 נוקלאוטידים לשנייה. לדקה. ניתן להאריך את האורך של 1kb, ומהירותו תלויה בהרכב תמיסת המאגר, ערך ה-pH, ריכוז המלח ואופי תבנית ה-DNA. אם המקטע המוגבר קצר מ-150bp, ניתן להשמיט את שלב ההארכה, והוא הופך למחזור טמפרטורה כפול, בגלל Taq DNA. הפולימראז מספיק כדי להשלים את הסינתזה של רצפים קצרים בטמפרטורת החישול. עבור קטעי רצף קצרים בין 100 ל-300 bp, יעיל להשתמש במחזור מהיר ופשוט של כפול טמפרטורות. בשלב זה, טמפרטורת הארכת פריימר זהה לטמפרטורת החישול. עבור שברי DNA מעל 1kb, ניתן לשלוט בזמן הארכה תוך 1 עד 7 דקות בהתאם לאורך השבר. במקביל, יש להוסיף ג'לטין או מגיב BSA למאגר ה-PCR כדי לשמור על פולימראז ה-Taq DNA פעיל ויציב לאורך זמן. מִין; 15%-20% גליצרול עוזר להגביר כ-2.5kb או יותר שברי DNA.
4. מספר המחזורים של PCR קונבנציונלי הוא בדרך כלל 25 עד 40 מחזורים. השגיאה הכללית היא שמספר המחזורים גדול מדי, הרקע הלא ספציפי חמור והמורכבות עולה. כמובן, מספר המחזורים של התגובה קטן מדי, והתשואה נמוכה. לכן, יש צורך לוודא שהמוצר מתקבל. בהנחה של קצב, יש למזער את מספר המחזורים.
לאחר השלמת ההגברה, הדגימה מקוררת ומאוחסנת ב-4 מעלות צלזיוס.
2. פריימר פריימר עיצוב
כדי להגביר את ה-DNA של התבנית, תחילה עליך לעצב שני פריימרים של אוליגונוקלאוטידים. מה שנקרא פריימרים הם למעשה שני שברי אוליגונוקלאוטידים המשלימים לרצף ה-DNA של המטרה שיש להגביר. המרחק בין שני הפריימרים קובע את אורך הפרגמנט המוגבר. , 5 קצוות' של שני הפריימרים קובעים את המיקומים של שני 5 קצוות' של המוצר המוגבר. ניתן לראות שהפריימרים הם המפתח לקביעת האורך, המיקום והתוצאות של הפרגמנטים המוגברים של PCR, ועיצוב הפריימר חשוב יותר.
התנאי ההכרחי לתכנון פריימר הוא שרצף ה-DNA של המטרה המשלים לפריימר חייב להיות ידוע. הרצף בין שני הפריימרים אינו בהכרח ברור. שני הרצפים הידועים הם בדרך כלל 15-20 בסיסים, אותם ניתן לסנתז באמצעות מסנתז DNA. בהתאם לשני פריימרים משלימים, בנוסף, העקרונות הנהוגים בדרך כלל בעיצוב פריימר כוללים:
1. אורך הפריימר מחושב לפי סטטיסטיקה, וההסתברות שיופיע רצף אוליגונוקלאוטידים של כ-17 בסיסים בגנום האנושי היא פעם אחת. לכן, אורך הפריימר הוא בדרך כלל לא פחות מ-16 נוקלאוטידים, והגבוה ביותר לא יותר מ-30 נוקלאוטידים, והאורך הטוב ביותר הוא 20-24 נוקלאוטידים. אוליגונוקלאוטידים קצרים כאלה לא יהוו הכלאה יציבה בטמפרטורת הפילמור (עוברת 72 מעלות צלזיוס). לפעמים זה יכול להיות ב-5' הוסף רצפים שאינם משלימים לתבנית בסוף, כגון אתרי אנזימי הגבלה או מקדמים, להשלמת שיבוט גנים וצרכים מיוחדים אחרים; ניתן להשתמש בתווית הקצה ביוטין של פריימר 5' או תווית פלורסנט למטרות שונות כגון זיהוי חיידקים.
לפעמים ה-primer'לא עובד, הסיבה לא ידועה, אתה יכול להזיז את המיקום כדי לפתור אותה.
2. ההרכב של (G+C)% תכולת פריימרים צריך להיות אחיד, ולנסות להימנע מלהכיל את אותו פולימר בסיס. התוכן (G+C)% בשני הפריימרים צריך להיות דומה ככל האפשר, במקטע המוגבר הידוע (G+C) % התוכן צריך להיות קרוב למקטע שיש להגביר, בדרך כלל 40% עד 60% עדיף.
3. החלק הפנימי של הפריימר צריך למנוע היווצרות של מבנים משניים ברורים, במיוחד מבנים סיכות ראש. לדוגמה:
4. לא אמורה להיות השלמה בין שני הפריימרים בין הפריימרים, במיוחד בקצה 3' של הפריימר. גם אם לא ניתן להימנע מכך, הבסיס המשלים 3'סוף לא צריך להיות גדול מ-2 בסיסים, אחרת קל ליצור"primer dimer" או" פריימר דימר" (פריימר דימר). מה שנקרא פריימר דימר הוא בעצם שבר דנ"א דו-גדילי שנוצר בהרחבה של פריימר אחד על רצף הפריימר השני תחת פעולת ה-DNA פולימראז. , הינו תוצר לוואי נפוץ של PCR, ולעיתים אף הופך להיות המוצר העיקרי.
בנוסף, הימנעו מרצפים הומולוגיים בין שני הפריימרים, במיוחד מקטעי אוליגונוקלאוטידים בעלי יותר מ-6 בסיסים זהים רצופים, אחרת שני הפריימרים יתחרו זה בזה על אותו אתר של התבנית; באופן דומה, הפריימרים וה-DNA היעד שיש להגביר או לרצפים אחרים של ה-DNA המדגם אינם יכולים להיות בעלי רצפים הומולוגיים של יותר מ-6 בסיסים. אחרת, הפריימרים ייקשרו לאתרים אחרים, יפחיתו הגברה ספציפית ויגדילו הגברה לא ספציפית.
5. פריימר 3' DNA פולימראז קצה מוסיף נוקלאוטיד בודד לקצה 3' של הפריימר. לכן, דרישות הזיווג של 5-6 בסיסים מקצה 3' של הפריימר וה-DNA היעד חייבות להיות מדויקות וקפדניות כדי להבטיח הגברה יעילה של PCR. .
האם עיצוב הפריימר סביר ניתן לאמת על ידי חיפוש במחשב באמצעות תוכנת PCRDESN ותוכנת PRIMER אמריקאית.
רצוי לטהר אוליגונוקלאוטידים המסונתזים באופן מלאכותי על ידי כרומטוגרפיה (כרומטוגרפיה) או PAGE כדי להסיר זיהומים כגון שרשראות קצרות שלא עברו סינתזה באורך מלא. פריימרים מטוהרים המאוחסנים בתמיסת אצטוניטריל 25% ב-4°C יכולים למנוע מיקרואורגניזמים בנסיבות רגילות, יש לאחסן פריימרים שאינם בשימוש במקרר ב-20°C. ניתן לאחסן את הפריימרים בנוזל למשך 6 חודשים, וניתן לאחסן אותם בין שנה לשנתיים לאחר הליאופיליזציה.
