שלבי צלחת תרבית תאים במעבדה

1. התאוששות תאים

לאחר הסרת התאים שנשמרו בהקפאה מהחנקן הנוזלי, הם הופשרו בניעור מתמיד באמבט מים של 37 מעלות. העבירו את התאים המופשרים לצינור צנטריפוגה, הוסיפו מדיום DMEM שלם שחומם מראש ב-37 מעלות (מתוכם סרום בקר עוברי הוא כ-10 אחוזים), נשפו בעדינות באופן שווה, צנטריפוגה ב-500 גרם למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט.

הוסף מדיום DMEM שלם לשטוף והשליך את הסופרנטנט. הוסף מדיום שלם של DMEM, ערבב בעדינות על ידי פיפטינג, צור תרחיף תאים, חיסן אותו בצלחת פטרי / בקבוק, והתרבות בחממת תאים המכילה 5 אחוז CO2.

2. מעבר תאים

כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-80% ~90% (תשואה מוקדמת אינה מספקת, תאים מאוחרים מדי במצב גרוע, תת-תרבות ביחס של 1:2 עד 1:10 או יותר, בדרך כלל יצירת תאים של 1:3 עד 1:5, כלומר, מחיסון תאים בזמן ההפרדה והטיפוח מחדש, המדיום המלא הוסר ונשטף פעמיים עם 1X PBS.

הוסף טריפסין (שימו לב: כמות תמיסת העיכול היא הטובה ביותר כדי לכסות את התאים, וטמפרטורת העיכול האופטימלית היא 37 מעלות. התבוננו בתאים במיקרוסקופ: התבוננו בתאים המעוכלים במיקרוסקופ הפוך, אם הציטופלזמה נסוגה, התאים אינם מחוברים יותר יחד. פרוסות, המעידות על כך שהתאים מעוכלים כהלכה בשלב זה), מעכלים אותם ומניחים אותם בחממה של תאים למשך כ-2-3 דקות.

הוסף כמות מתאימה של מדיום DMEM שלם כדי לעצור את הטריפסיניזציה, העבר לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-500 גרם למשך 2 דקות, השלך את הסופרנטנט, הוסף מדיום DMEM שלם לשטוף, והשליך את הסופרנטנט.

הוסף מדיום DMEM שלם, ערבב על ידי פיפטציה בעדינות, פיפטט 10 מיקרוליטר לספירה, ולאחר מכן המשך לתרבית בחממת תאים המכילה 5 אחוז CO2 בהתאם לנפח התא הנדרש.

3. שימור תאים

כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-80% ~90%, הסר את המדיום המלא ושטוף פעמיים עם 1X PBS. הוסף טריפסין לעיכול והנח באינקובטור תאים למשך כ-2-3 דקות. הוסף מדיום DMEM שלם כדי לעצור את עיכול הטריפסין, העבר לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-500 גרם למשך 2 דקות, השלך את הסופרנטנט, הוסף מדיום DMEM שלם לשטוף, והשליך את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של תמיסת הקפאה (90 אחוז סרום בקר עוברי, 10 אחוז DMSO. באופן כללי, ניתן להתאים את תכולת הסרום בין 10 אחוז ל-90 אחוז. הוספת סרום לתמיסת ההקפאה יכולה לספק חומרי הזנה לתאים מצד אחד, ויכולה ספק חומרי הגנה בלתי חדירים במהלך הקפאת התאים, כגון סוכרוז, אלבומין וכו' כדי להגן טוב יותר על התאים), הכניסו אותו לשפופרת להקפאה (יש איזופרופיל אלכוהול בצינור כדי להבטיח את מהירות הפחתת הטמפרטורה), הכניסו אותו מיד. מקפיאים במקרר 4 מעלות למשך 30 דקות, לאחר מכן מניחים אותו במקרר של -20 מעלות למשך 30 דקות, ולאחר מכן מניחים אותו במקרר של -80 מעלות למשך הלילה.

שים אותו בחנקן נוזלי למחרת, אפשר לשמור אותו לפחות שנתיים, ואם לא שמים אותו בחנקן נוזלי אפשר לשמור אותו לשלושה חודשים.

העיקרון של הקפאה והתאוששות של התאים הוא: הקפאה והפשרה איטית, מה שתורם יותר לשמירה על כדאיות התא. שימור הקפאה של תאים ללא כל חומר מגן יוביל לייצור גבישי קרח תוך תאיים, אשר יגרום לנזק מכני אנדוגני לתאים, יגרום לשינויים בלחץ האוסמוטי של הסביבה התוך תאית, pH, אלקטרוליטים וכו', ולאחר מכן יקדם מוות של תאים.

4. עניינים הדורשים תשומת לב

(1) חימום מראש של תמיסת התרבית: הכניסו את הבקבוק המוכן המכיל את תמיסת התרבית, PBS וטריפסין לאמבט מים של 37 מעלות לחימום מוקדם;

(2) השתמשו ב-75 אחוז אלכוהול כדי לנגב את שולחן העבודה והידיים הנקיות במיוחד שהוקרנו בקרניים אולטרה סגולות;

(3) מיקום נכון של מכשירים משומשים: להבטיח שטח הפעלה מספיק, אשר לא רק קל לתפעול אלא גם מפחית זיהום;

(4) הדליקו את מנורת האלכוהול: שימו לב שהלהבה לא צריכה להיות קטנה מדי;

(5) פעולה אספטית קפדנית;

(6) עיכול מתון של תאים נצמדים: זמן העיכול מושפע מגורמים רבים כמו סוג תמיסת העיכול, זמן ההכנה והכמות המוספת לבקבוק התרבית. בתהליך העיכול יש לשים לב לשינויים בצורת התאים התרבותיים. ברגע שהציטופלזמה מתכווצת, אם הקשר מתרופף, או שיש סימנים של ציפה בחתיכות, יש להפסיק את העיכול באופן מיידי;

(7) כל הפעולות בתאים מעבר צריכות להיות קרובות ככל האפשר ללהבה של מנורת אלכוהול. עדיף לעבוד עם תא אחד בלבד בכל פעם, תוך שימוש בסט אחד של ציוד לכל תא. להימנע מזיהום צולב;

(8) יש לעקר את פי הבקבוק של התא המעובר על מנורת אלכוהול בכל פעם שהוא נפתח או סגור.