כשרק סיימת את הלימודים ונכנסת לתפקיד, אתה עומד בפני חבורה של שמות עצם העומדים בפני ניסויי PCR כמותיים בזמן אמת. האם אתה מבולבל מאיפה להתחיל? מה הפירוש של עקומת הגברה, עקומת תקן, סף, ערך CT, עקומת התכה ובסיס? תמונות הפלורסנט מהניסויים האלה בהירות מדי, אבל אני לא מצליח לזהות אותן. היום, ניקח אותך ללמוד את הידע והמושגים הללו בשני חלקים: מונחים טכניים ושאלות נפוצות.
חלק א' תנאים מקצועיים
1. עקומת הגברה
עקומת ההגברה מתייחסת לעקומה שבה מספר המחזור הוא האבססיס ועוצמת הקרינה בזמן אמת במהלך התגובה היא ה-ordinate במהלך ה-PCR.
2. קו בסיס
קו הבסיס מתייחס לשינוי קטן באות הפלורסנט במהלך המחזורים הראשונים של תגובת הגברה של PCR. רמת האות מראה קרוב לקו ישר, שהוא קו הבסיס.
3. הגדרת סף פלואורסצנטי
בדרך כלל, אות הקרינה של 15 המחזורים הראשונים של תגובת PCR משמש כאות רקע הקרינה, וסף הקרינה הוא פי 10 סטיית התקן של אות הקרינה במהלך 3-15 מחזורי PCR, וסף הקרינה. מוגדר במהלך השלב האקספוננציאלי של הגברה של PCR. בדרך כלל, לכל מכשיר יש את סף הקרינה שלו לפני השימוש.
4. ערך CT
ערך ה-CT מייצג את מספר המחזורים שיתרחשו עבור כל צינור תגובה של PCR כאשר האות הפלורסנט יגיע לסף שנקבע. ממחקר, אנו יודעים שיש קשר ליניארי בין ערך ה-CT של כל תבנית ללוגריתם של מספר העותק ההתחלתי של אותה תבנית. ככל שמספר העותק הראשוני גבוה יותר, כך ערך ה-CT קטן יותר ולהיפך. באמצעות תקנים עם מספרי עותקים התחלתיים ידועים, ניתן ליצור עקומת כיול כאשר האבשיסה מייצגת את הלוגריתם של מספר העותק ההתחלתי, בעוד שהאורדינאטה מייצגת את ערך ה-CT. לכן, כל עוד מתקבל ערך ה-CT של הדגימה הלא ידועה, ניתן לחשב את מספר העותק הראשוני של הדגימה מהעקומה הסטנדרטית.
יודע יותר
ישנם מספר אינדיקטורים לשפוט האם עקומת ההגברה טובה או לא:
תשובה: נקודת הפיתול של העקומה ברורה, במיוחד השלב האקספוננציאלי של מדגם השבר הנמוך-כבד ברור, ההקבלה הכללית של עקומת ההגברה טובה מאוד, קו הבסיס שטוח, אין תופעה עולה, וההגברה עקומת דגימת ריכוז הפאזה המעריכית ברמה נמוכה היא טובה מאוד. ברור.
ב: השיפוע של השלב האקספוננציאלי של העקומה עומד ביחס ישר ליעילות ההגברה, ככל שהשיפוע גדול יותר, כך יעילות ההגברה גבוהה יותר.
ג: קו הבסיס הסטנדרטי הוא שטוח או מעט יורד, ללא מגמת עלייה נראית לעין.
ד: ההקבלה של עקומות ההגברה עבור כל צינור טובה, מה שמצביע על כך שיעילות ההגברה של כל צינור תגובה דומה.
5. עקומת התכה
כאשר תוצר ה-PCR מחומם, ככל שהטמפרטורה עולה, תוצר ההגברה הדו-גדילי מתנתק בהדרגה, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמת הקרינה. כאשר מגיעים לטמפרטורה מסוימת, כמות גדולה של מוצר נפרדת, וכתוצאה מכך ירידה חדה בקרינה. שימוש בפונקציה זו יחד עם ערכי TM שונים עבור מוצרי PCR שונים גם שונה בטמפרטורה שבה האות הפלורסנט יורד במהירות, מה שעשוי להיות דרך טובה לזהות סגוליות PCR.
6. עקומת התכה (באמצעות עקומה לוגריתמית)
גרף השיא נוצר על ידי הלוגריתם של עקומת ההיתוך כדי להציג בצורה אינטואיטיבית יותר את המצב של שברי המוצר. מכיוון שטמפרטורת ההיתוך היא ערך ה-TM של מקטע DNA, ניתן לקבוע פרמטרים מסוימים המשפיעים על ערך ה-TM של מקטע DNA, כגון גודל המקטע, תכולת ה-GC וכו'. בדרך כלל, על פי עיקרון עיצוב הפריימר שלנו, נאמר בדרך כלל שאורך המוצר המוגבר הוא בטווח של 80-300bp, וטמפרטורת ההיתוך צריכה להיות בין 80 מעלות ל-90 מעלות.
ת: אם יש רק שיא עיקרי אחד בין 80 מעלות ל-90 מעלות, זה אומר שה-PCR בזמן אמת מושלם.
ב: אם השיא הראשי מופיע בין 80 מעלות ל-90 מעלות, ושיא הטומאה מופיע מתחת ל-80 מעלות, הפריימר-דימר נחשב בעצם. זוהי אפשרות טובה לנסות לפתור על ידי העלאת טמפרטורת החישול.
ג: אם השיא הראשי מופיע בין 80 מעלות ל-90 מעלות, ושיא נודד מופיע כאשר הטמפרטורה עולה, זיהום DNA נחשב בעצם. ויש להסיר את ה-DNA בשלבים הראשונים של הניסוי.
7. קו עקומה סטנדרטי
תקנים סטנדרטיים דוללו לריכוזים שונים ושימשו כתבניות לתגובות PCR. עקומת התקן משורטטת עם הלוגריתם של מספר העותק הסטנדרטי כאבססיס וערך ה-CT הנמדד כאורדינאטה. בעת כימות מדגם לא ידוע, ניתן לקבל את מספר ההעתקה של המדגם מהעקומה הסטנדרטית המבוססת על ערך ה-CT של המדגם הלא ידוע. עקומות סטנדרטיות חשובות מאוד לכימות מוחלט.
החלק השני. בעיה נפוצה
שאלה 1: מה ההבדל בין RT-PCR, QPCR, PCR בזמן אמת ו-RT-PCR בזמן אמת?
A1: RT-PCR הוא PCR שעתוק הפוך, שהוא גרסה בשימוש נרחב של תגובת שרשרת פולימראז. ב-RT-PCR, גדיל ה-RNA מועתק לאחור ל-DNA משלים, המשמש לאחר מכן כתבנית ל-PCR להגברת ה-DNA באמצעות PCR.
בזמן אמת PCR ו-QPCR הם אותו דבר, שניהם הם PCR כמותי בזמן אמת, כלומר יש הקלטה בזמן אמת של נתונים בכל מחזור במהלך תהליך ה-PCR. בדרך זו, ניתן לנתח במדויק את מספר תבניות ההפעלה.
למרות שנראה שגם PCR בזמן אמת וגם PCR שעתוק הפוך מקוצרים כ-RT-PCR, האמנה הבינלאומית היא ש-RT-PCR מתייחס ספציפית ל-PCR שעתוק לאחור, בעוד ש-PCR בזמן אמת מקוצר לעתים קרובות כ-qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - זמן PCR).
RT-PCR בזמן אמת (RT-QPCR) הוא סוג של שיעתוק הפוך PCR המשלב טכניקות כמותיות פלואורסצנטיות: תעתיק הפוך מ-RNA ראשון להשגת cDNA (RT), ואחריו ניתוח כמותי באמצעות PCR בזמן אמת (QPCR).
ש2: מדוע אורך קטע המוצר המוגבר של PCR כמותי פלואורסצנטי נשלט בטווח של 80-300bp?
ת2: אורכו של כל רצף גנים שונה, חלקם הם כמה Kb ומאות BP. עם זאת, כאשר אנו מעצבים את הפריימר, אנו צריכים רק לדרוש שאורך המוצר יהיה 80-300bp, וקצר מדי או ארוך מדי אינו מתאים לזיהוי PCR כמותי.
שברי מוצר קצרים מכדי להבחין בין פריימר-דימרים. אורך הפריימר-דימר הוא בערך 30-40bp, כאשר הוא פחות מ-80bp, קשה להבחין אם זה פריימר-דימר או מוצר. אם קטע המוצר ארוך מדי, עולה על 300bp, זה יוביל בקלות ליעילות הגברה נמוכה, ולא ניתן לזהות ביעילות את כמות הגן.
לדוגמה, כאשר אתה סופר את מספר האנשים בכיתה, אתה רק צריך לספור כמה פיות יש. הדבר נכון כאשר בודקים גנים. אתה רק צריך לזהות רצף מסוים של גן כדי לייצג את הרצף כולו. קל לטעות אם אתה סופר גם פיות וגם אפים, אוזניים ומשקפיים כדי לספור אנשים.
ש 3: מהו האורך האופטימלי עבור עיצוב הפריימר?
A3: באופן כללי, אורכי פריימר בטווח של 20-24bp טובים. כמובן שעלינו לשים לב לערך ה-TM של הפריימר בעת תכנון הפריימר, כי הוא קשור לטמפרטורת החישול האופטימלית. לאחר הרבה ניסויים, הוכח ש-60 מעלות הוא ערך TM טוב. טמפרטורת חישול נמוכה יכולה להוביל בקלות להגברה לא ספציפית, בעוד שטמפרטורת חישול גבוהה מובילה בדרך כלל ליעילות הגברה נמוכה, לשיא מאוחר של עקומת ההגברה ולערך CT מושהה.
שאלה 4: האם כמות המדגם שנאספה משפיעה על תוצאות הניסוי?
A4: לא. ברור שככל שיאספו יותר דגימות, כך נשלף יותר RNA, יותר cDNA, ויהיו יותר שברי מטרה. עבור כימות מוחלט, יש צורך לחשב את מספר העותק של שבר היעד, וכמות הדגימה שנאספה בהחלט תשפיע על תוצאות הניסוי. לדוגמה, זיהוי HBV של וירוס הפטיטיס C בדם נועד לזהות את תכולת ה-HBV בכמות מסוימת (1 מ"ל) של דם.
עבור כימות יחסי הנפוץ במחקר מדעי, למספר הדגימות אין שום קשר לתוצאות הניסוי, מכיוון שכימות יחסי מתייחסת להשוואה בין גן המטרה לגן הייחוס. רק בבקשה שקול אותם כמקטעים במעלה הזרם ומורד הזרם הנמצאים באותו גדיל חומצת גרעין. אם גודל המדגם גדול, גם גני ההתייחסות והיעד מוגדלים בפרופורציות שווים בו זמנית, מה שלא משפיע על התוצאות.
שאלה 5: האם היעילות של תעתיק הפוך תשפיע על תוצאות הניסוי?
A5: אותו דבר כמו לעיל. שימו לב שאנו רוצים יעילות RT גבוהה יותר, אך אנו מעדיפים שהאנזים RT יהיה יציב יחסית ויקבל תוצאות אחידות. זה יהיה מבחן של היכולות הממוטבות של חבילות התמלול ההיפוך של החברות הגדולות.
שאלה 6: האם היעילות של אנזים TAQ משפיעה על תוצאות הניסוי?
ת6: היעילות של אנזים TAQ גדולה יחסית. בדרך כלל, דרושים אנזימים של טאק התחלה חמה והם יעילים יחסית. עבור ערכות כמותיות קרינה מסחריות, כל יצרן ייעל את היעילות של המצב הטוב ביותר בהתאם למוצרים שלו קרוב ל-100 אחוז, אם היעילות נמוכה מדי, לא ניתן להשיג את תוצאות הניסוי. עבור מוצרים של חברות שונות, זהו מדד לאיכות.
שאלה 7: האם כמות הצבע הפלורסנטי משפיעה על תוצאות הניסוי?
A7: כן, זה יהיה. אם הפלואורוכרום רווי מדי, הוא עלול לגרום להפרעות רעש במכשירים מסוימים. אם הפלואורוכרום אינו רווי, וערך הקרינה נמוך מדי, הוא ייכנס לשלב מישור מוקדם ועקומת ההגברה תהיה שטוחה. בניסוי הכמותי הקרינה רואים בעיקר את ערך ה-CT ולכן אין חשיבות לעקומת ההגברה המאוחרת להיכנס לשלב הרמה, אך התמונה לא מספיק יפה. אם היית צריך לבחור, התחל בבחירת פלואורכרום שהוא מעט פחות רווי. עם זאת, כאשר משתמשים באותו מוצר מאותה חברה, ההשפעה שלו זניחה בעצם.
שאלה 8: האם השידור של צינור ה-PCR ישפיע על תוצאות הניסוי?
A8: כן. עם זאת, עבור אותה אצווה של חומרים מתכלים מאותו יצרן, ניתן להתעלם מהשפעה זו. זוהי בחירה טובה ועדיף להשתמש בצלחת 96-באר עם ממברנה בעלת חדירות גבוהה כדי למזער את השפעת העברת האור של החומרים המתכלים.
ש9: האם שגיאות במהלך הפעולה ישפיעו על תוצאות הניסוי?
ת9: השפעת תהליך הפעולה באה לידי ביטוי בעיקר באחידות. הומוגניות פירושה שכל הרכיבים במערכת מעורבבים זה בזה באופן שווה, וצנטריפוגה הבזק יכולה לפתור בעיה זו. בנוסף, למתחילים, עדיף להתאים את מערכת ה-PCR ליותר מ-20 אינץ', ומערכת קטנה מדי חשופה יותר לשגיאות. אם טמפרטורת החישול עוברת אופטימיזציה נכונה, ההשפעה של ריכוז פריימר על CT ממוזערת. ותדע שניתן למנוע כמה שגיאות תפעוליות (כגון ריכוז פריימר) על ידי אופטימיזציה של טמפרטורת החישול.
לְסַכֵּם
האמור לעיל הוא כמה שאלות ושאלות שמתחילים נתקלים בהן לעתים קרובות במהלך הניסוי, אנו מקווים שהשאלות הללו יכולות לעזור לך לפתור קצת בלבול. ניסוי הוא תהליך של יצירת כאוס ופתרון בעיות, מקווה שתפיק מזה משהו. תודה שקראתם ונתראה בפעם הבאה!